克隆前进行去磷酸化

发布时间： 2021-04-07 13:25点击次数：

在克隆方案中，将DNA片段连接到质粒载体中。特别是如果用单个限制酶切割载体，则载体重新结合在自身上而不是在添加的DNA片段上重新结合的机会要高得多。这导致很大一部分的“空克隆”或背景。

碱性磷酸酶通常用于减少DNA片段克隆过程中空的，重新连接的载体的背景，因为脱磷酸的DNA末端不能被DNA连接酶连接。磷酸酶处理可以有效地将“空”克隆的背景降低95％以上。但是，克隆程序以及磷酸酶处理可能很麻烦且容易出错。

SAP可为该过程提供更大的便利，因为可以通过简单的热灭活步骤将酶完全去除。SAP在用于限制酶的所有缓冲液中均具有活性，因此可以在限制酶切消化过程中或之后直接添加SAP。
使用SAP，用户可以忘记繁琐的计算和多步温育，因为该酶在一次简单的温育过程中会完全使DNA脱磷酸。

协议包括限制削减

在此协议中，SAP在限制切割过程中存在，因此末端一形成便会被去磷酸化。在该方案中，SAP的最小有效量与添加的限制酶的量（即末端形成的速率）成正比。简单来说，每单位限制酶至少使用0.1 U SAP，然后进行完全切割。限制酶的用量可能与以下方案有所不同，请使用供应商推荐的用量。

在37°C下孵育1小时，按照所用限制酶的建议将其灭活。进行连接方案。

使用大量的SAP可以在短时间内实现有效的去磷酸化。限制性酶切完成后，只需将每µg载体5 U SAP加到您的限制性酶切混合物中，并在37°C孵育5分钟。按照限制酶的建议灭活。进行连接方案。